液相色谱、EICOEE色谱柱、气相色谱 - 艾可依生物科技(山东)有限公司

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HILIC模式色谱柱使用注意事项

查看次数:6969 更新时间:2022-04-29

亲水作用色谱(HILIC)是互补于RP的色谱技术,它可以成功的提高对极性非常大的物质的保留,同时还可以为极性物质和可离子化物质的混合物提供正交于RP的分离模式。它是通过采用高乙腈低水含量的流动相与极性固定相的组合,按亲水性(极性)由小到大的顺序梯度洗脱分析物得以实现的。

亲水作用色谱(HILIC)是互补于RP的色谱技术,它可以成功的提高对极性非常大的物质的保留,同时还可以为极性物质和可离子化物质的混合物提供正交于RP的分离模式。它是通过采用高乙腈低水含量的流动相与极性固定相的组合,按亲水性(极性)由小到大的顺序梯度洗脱分析物得以实现的。


HILIC模式保留机理

ACE色谱柱.png

在HILIC模式中,保留机制是液液分配、吸附作用、离子相互作用和亲水性保留作用的复杂的多模式组合,从而使HILIC与RPLC相比具有独特的选择性和保留特性。然而,单一的保留机制并非主导所有的分离。分析物的成功保留主要取决于流动相的组成(有机溶剂和pH)、流动相与固定相的相互作用及分析物的化学性质和结构组成。


ACE色谱柱.png

HILIC模式综合了液液分配、离子交换和氢键等作用,因此在使用方面与反相色谱柱差异较大,注意事项如下:


01、流动相的选择性和洗脱强度


部分流动相必须含有极性溶剂(至少3%),这样亲水层才可吸附到固定相表面。通过降低流动相的总体极性,促使溶质分离至该水层,从而保留反相色谱无法保留的极性化合物。


对于HILIC中溶剂的洗脱强度,乙腈通常为基本的或弱的溶剂,而水则是最强的洗脱溶剂。


ACE色谱柱.png

02、样品稀释剂


HILIC性能不佳(例如峰形扭曲、柱效低下和信号轻度低等)的主要原因之一与溶解样品的溶剂相关。一部分原因在于流动相主体和样品溶剂之间的粘度和极性差异。


由于HILIC中的弱流动相组分为乙腈,样品稀释剂理想上与初始流动相条件具有相同的乙腈组成。然而,难点在于大多数极性分析物在高有机比例溶剂中的溶解度有限。此外,将极性太强的洗脱溶剂(水、甲醇或者异丙醇)用做样品稀释剂对样品溶解度可能有负面影响。


水和甲醇均为强溶剂,避免单独作为稀释剂使用,推荐使用乙腈/甲醇(75/25),若样品为水溶性,可先用水溶解,再用乙腈稀释后进样。

ACE色谱柱.png


03、色谱柱的活化平衡


(1)活化流程


新色谱柱用纯乙腈排完气泡后,用50倍柱体积的乙腈/水(50/50)活化


色谱柱柱体积可参考下表:

ACE色谱柱.png

(2)平衡


HILIC新色谱柱建议用50倍柱体积含有10mM缓冲盐或者0.2%添加剂溶液的(乙腈/水 50:50)平衡(一般根据分析方法确定平衡条件)后再测试样品,在常规使用前一般需要用20倍柱体积的初始流动相平衡色谱柱。不充分的平衡时间将导致保留时间漂移。


04、色谱柱的清洗及保存


(1)清洗


体系不含盐时,可以梯度洗脱从95/5(乙腈/水) 至50/50(乙腈/水)以去除极性污染物,如果不能解决问题,可用梯度洗脱从97/3(乙腈/水)至5/95(乙腈/水)冲洗。


(2)保存


短期存放可放在乙腈/水(95/5)中,若长期不使用,需保存在纯乙腈内,并将色谱柱两端的堵头拧紧封好,以防柱床“干涸”。

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