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硅胶基质色谱柱的清洗、再生和储存

查看次数:485 更新时间:2021-07-05

一般注意事项 强烈建议日常使用在线过滤器和/或保护卡套柱,以保护HPLC柱免受熔块堵塞和不可逆的样品吸附。然而,即使使用了保护卡套柱,色谱柱在使用一段时间后仍可能会被吸附性强的样品成分污染。这可能表现为柱子产生的背压突然或逐渐增加、柱效降低、拖尾峰和肩峰增加甚至出现裂峰。

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一般注意事项

强烈建议日常使用在线过滤器和/或保护卡套柱,以保护HPLC柱免受熔块堵塞和不可逆的样品吸附。然而,即使使用了保护卡套柱,色谱柱在使用一段时间后仍可能会被吸附性强的样品成分污染。这可能表现为柱子产生的背压突然或逐渐增加、柱效降低、拖尾峰和肩峰增加甚至出现裂峰。

建议对UHPLC色谱柱进行保护,并在允许的情况下使用保护卡套柱。并非所有制造商的UHPLC色谱柱都能匹配到能够承受所需高压的保护卡套柱。在这些情况下,建议使用可在高压下运行的柱前过滤器。为了最大限度地延长色谱柱的使用寿命,特别是UHPLC色谱柱,应注意以下几点:

- 仅使用超纯UHPLC/HPLC级溶剂

- 使用新制备的流动相以抑制细菌生长

- 过滤所有样品、标准品和流动相(例如0.22μm 过滤器)

- 使用在线过滤系统

- 对脏样品进行样品预处理

请注意,在发生不可逆化合物吸附或柱空隙的情况下,可能无法再生色谱柱。


色谱柱的冲洗

如果观察到色谱柱柱效变差或背压增加,则可使用一系列强溶剂组合来执行色谱柱的清洗或再生程序。强烈建议在开始本程序之前阅读制造商提供的“ 维护和使用”说明。虽然大多数球形 3、5、10μm 粒径的色谱柱可以反向冲洗甚至反方向使用, 但有些3μm粒径的色谱柱只能承受短时间内反向冲洗,并且之后不宜反方向使用。对于不规则颗粒填充的色谱柱,建议沿正常流动方向冲洗。

对于 UHPLC(≤2μm)色谱柱,在考虑对色谱柱进行反向冲洗之前,必须参考制造商的“维护和使用”说明。在某些情况下,最好沿正常流动方向冲洗 UHPLC色谱柱。

建议在执行某清理程序或长期储存之前和之后, 使用制造商测试色谱图上给出的测试条件或所遵循方法中的测试条件来测量其柱效。这样就可以监控该清洗程序的有效性。


色谱柱清洗程序

建议采用以下通用程序进行色谱柱性能的再生

1 拆掉并(如果可行)反转色谱柱。

2 将色谱柱连接到泵上,不接检测器。

3 按照色谱柱类型相应的冲洗程序(见下文),每种溶剂使用10-20个柱体积(见表1)。始终确保最后使用的溶剂能与流动相混溶。

4 流速不应超过该色谱柱QC色谱图上规定的流速。


各类色谱柱的冲洗程序

反相色谱柱

(例如C18、C8、C4、苯基、氰基、AQ 型)


a) 流动相不含缓冲液

b) 甲醇

c) 乙腈

d) 乙腈/IPA(75:25)

e)  IPA

f) 氯甲烷

g) 己烷

注意:在许多情况下,执行步骤a到e可能就足够了。如果需要执行步骤f或g时,在返回流动相之前,用IPA冲洗。如果认为金属离子是污染的来源,应使用0.05M EDTA水溶液冲洗,然后再用水冲洗。使用过离子对试剂的色谱柱最好专门使用该方法处理,并且持续专用于该类测试。


蛋白质/肽分析用反相色谱柱


a) 流动相不含缓冲液

b) 0-90%B梯度;

其中A=0.1%TFA的水溶液; 

B=0.1%TFA的乙腈溶液


未键合的硅胶柱(SIL)


a) IPA

b) 甲醇

c) 乙酸乙酯


键合正相色谱柱(氰基、氨基、二醇基)


a) 二氯甲烷

b)  IPA

c) 二氯甲烷

d) 己烷


阴离子交换柱(SAX, WAX)


a) 水

b) 甲醇

c) 三氯甲烷

d) 甲醇

e) 水


阳离子交换柱(SCX, WCX)

a) 水(冲洗时注入4x200μl的DMSO)

b) 四氢呋喃


蛋白质的体积排阻柱对于弱保留的蛋白质


a) 0.1M 磷酸盐缓冲液,pH 值3对于强保留的蛋白质

b) 100%水至100%乙腈的梯度,运行60分钟


硅胶基质HPLC色谱柱的储存条件

色谱柱的存储条件将影响其使用寿命。在储存前,应将色谱柱中的所有缓冲液、盐和离子对试剂冲洗出来。理想情况下,储存溶剂应与制造商提供的色谱柱初始测试色谱图所示的溶剂一致。应安装好柱两端堵头,以防止溶剂蒸发以及随之而来的填料床变干燥。


表1:常规色谱柱尺寸(全多孔硅胶)的预估柱体积(mL)

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