色谱分析的重要作用之一是对样品定量。而色谱法定量的依据是:组分的重量或浓度与检测器的响应信号成正比。
常见定量分析方法分有面积归一化法、外标法、内标法等。
一、面积归一化法
由于组分的量与其峰面积成正比,如果样品中所有组分都能产生信号,得到相应的色谱峰,那么可以用如下归一化公式计算各组分的含量。
归一化法的优点:简便、准确、定量结果与进样量重复性无关(在色谱柱不超载的范围内)、操作条件略有变化时对结果影响较小。
归一化法的缺点:必须所有组分在一个分析周期内都流出色谱柱,而且检测器对它们都产生信号。不适于微量杂质的含量测定。
二、外标法
首先用待测组分的标准样品绘制标准工作曲线。
具体作法是:用标准样品配制成不同浓度的标准系列,在与待测组分相同的色谱条件下,等体积准确量进样,测量各峰的峰面积或峰高,用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线,此标准工作曲线应是通过原点的直线。
若标准工作曲线不通过原点,说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。
外标法的优点:方法简便,不需用校正因子,不论样品中其他组分是否出峰,均可对待测组分定量。绘制好标准工作曲线后,可直接从标准工作曲线上读出含量,这对大量样品分析十分合适。特别是标准工作曲线绘制后可以使用一段时间,在此段时间内可经常用一个标准样品对标准工作曲线进行单点校正,以确定该标准工作曲线是否还可使用。
外标法的缺点:此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响,因此容易出现较大误差。
三、内标法
选择适宜的物质作为待测组分的参比物,定量加到样品中去,依据待测组分和参比物在检测器上的响应值(峰面积或峰高)之比和参比物加入的量进行定量分析的方法称为内标法。
内标法的关键是选择合适的内标物。内标物应是原样品中不存在的纯物质,该物质的性质应尽可能与欲测组分相近,不与被测样品起化学反应,同时要能完全溶于被测样品中。内标物的峰应尽可能接近欲测组分的峰,或位于几个欲测组分的峰中间,但必须与样品中的所有峰不重叠,即完全分开。
内标法的优点:进样量的变化,色谱条件的微小变化对内标法定量结果的影响不大,特别是在样品前处理(如浓缩、萃取,衍生化等)前加入内标物,然后再进行前处理时,可部分补偿欲测组分在样品前处理时的损失。若要获得很高精度的结果时,可以加入数种内标物,以提高定量分析的精度。
内标法的缺点:选择合适的内标物比较困难,内标物的称量要准确,操作较麻烦。
选择内标物有4个要求:
1.内标物应是该试样中不存在的纯物质;
2.它必须完全溶于试样中,并与试样中各组分的色谱峰能完全分离;
3.加入内标物的量应接近于被测组分;
4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近,或在几个被测组分色谱峰中间,且又不共溢出,目的是为了避免仪器的不稳定性所造成的灵敏度的差异。