液相色谱、EICOEE色谱柱、气相色谱 - 艾可依生物科技(山东)有限公司

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【干货分享】样品性质与柱分离模式的选择 ​

查看次数:602 更新时间:2021-11-12

当进行液相色谱分析时,如不了解样品的性质和组成,选用何种液相色谱分离模式就成为难题。为解决此问题,应首先了解样品的溶解性质,判断样品分子量的大小以及可能存在的分子结构及分析特性,最后再选择液相色谱分离模式,完成对样品的分析。

当进行液相色谱分析时,如不了解样品的性质和组成,选用何种液相色谱分离模式就成为难题。为解决此问题,应首先了解样品的溶解性质,判断样品分子量的大小以及可能存在的分子结构及分析特性,最后再选择液相色谱分离模式,完成对样品的分析。

ACE色谱柱

1 样品的溶解度


样品在有机溶剂和水溶液中的相对溶解性是样品最重要的性质。


根据样品在有机溶剂中溶解度的大小,初步判断样品是极性化合物还是非极性化合物,进而推断用非极性溶剂戊烷、己烷或者庚烷等,还是用甲醇、乙腈等来溶解样品,并通过实验判断。


如果样品溶于非极性溶剂,表明样品为非极性化合物,通常可选用吸附色谱法或者正相分配色谱法、正相键合色谱法进行分析。若样品溶于极性溶剂或相混溶的极性溶剂,标明样品为极性化合物,通常可选用反相分配色谱法或更为广泛应用的反相键合相色谱法分析。


如果样品溶于水相,可首先检查水溶液的pH值,若呈中性为非离子性组分,常可用反相(或正相)键合相色谱法进行分析。若pH值呈弱酸性,可采用抑制样品电离的方法,在流动相中加入磷酸调节pH值为2-3,再用反相键合相色谱法进行分析。若pH值呈弱碱性,则可向流动相中加入阳离子型反离子,再用离子对色谱法分析。若pH值呈强酸性或者强碱性,则可用亲水作用色谱或者离子色谱法分析。


2 样品的分子量

对于油性分子量小于2000且分子量差别不大的样品,若为非离子型,则应考虑是否为同分异构体或具有不同极性的组分,此时可采用吸附色谱法或键合相色谱法分离;若为离子型,则可用离子色谱分析。对于油性分子量小于2000且分子量差别很大的样品,则仅能用刚性凝胶的凝胶渗透色谱法或者键合相色谱法分析。若油性样品的分子量大于2000,则采用聚苯乙烯凝胶的凝胶渗透色谱法分析。


对于水性分子量小于2000且分子量差别不大的样品,可考虑选用吸附色谱法或分配色谱法分析。若分子量差别很大,则仅能用刚性凝胶的凝胶渗透色谱法分离;若分子量差别较大,且呈离子型,对强电离的可使用亲水作用色谱或总离子对色谱法分离,对弱电离的可用离子色谱分析。若水性样品的分子量大于2000,则采用聚醚为基体凝胶的凝胶渗透色谱法分析。


3 样品的分子结构和分析特性


  Ⅰ 同系物的分离


同系物都具有相同的官能团,表现出相同的分析特性,其分子量呈现有规律的增加。对于同系物可采用吸附色谱法,分配色谱法或键合相色谱法分析。同系物在谱图上都表现出随分子量的增加,保留时间增大的特点,不需使用提高柱效的方法来改善各组分的分离度。


  Ⅱ 同分异构体的分离


对双键位置异构体(即顺反异构体)或芳香族取代基位置不同的邻、间、对异构体,最好选用吸附色谱法进行分离。此时可充分利用硅胶吸附剂对异构体具有高选择性的特点,来实现满意的分离。


对多环芳烃异构体,分析量相同,分子结构不同,具有不同的疏水性。此时可选用反相键合相色谱法和疏水作用色谱法,利用样品分子疏水性的差别来实现分离。


 Ⅲ 对映异构体的分离


当前对具有特殊选择性的对映异构体的分离,已成为高效液相色谱法研究的热点,它在高疗效的新型药物的质量检验中非常重要。使用通常的高效液相色谱方法无法将对映异构体分离,必须使用具有光学活性的固定相(如键合β-环糊精)或者在流动相中加入手性选择剂才能将他们分离。


 Ⅳ 生物大分子的分离


对于像蛋白质和核酸这类生物大分子,应该首先了解他们的结构特点。如蛋白质的分子量一般在1*104——20*104,这类大分子的扩散系数要比小分子低1-2个数量级,蛋白质是由氨基酸缩聚构成的肽链进一步连接生成的大分子,其分子侧链连接有羟基、巯基、羧基、氨基等多种亲水基团,表面呈亲水性。分析蛋白质可采用反相键合色谱法,其可实现对不同蛋白质的良好分离。但所用流动相中的甲醇、乙腈和四氢呋喃会使蛋白质分子变性而丧失生物活性,因此更宜采用疏水作用色谱法、凝胶过滤色谱法或亲和色谱法对蛋白质进行分析。


由上述对高效液相色谱分离模式的选择,可以看出,反相键合相色谱法获得最广泛的应用。它仅使用C18色谱柱,以甲醇-水或者乙腈-水为流动相,或经梯度洗脱,就可以得到较满意的初步结果。


亲水作用色谱解决了极性小分子的分析需求,迅速发展成为仅次于反相液相色谱的第二种分析方法。


体积排阻色谱法在判定样品分子量大小方面有独特的作用,且样品组分能够在较短的时间内洗脱出来,但它不适合分离组成复杂的混合物。


离子色谱法仅限于在水溶液中分离各种离子,其应用范围不如其他液相色谱法广。


亲和色谱法由于具有突出的选择性,在生物样品的分析和纯化制备中发挥了越来越重要的作用。


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